北野　健　(助教授)　　　　　　

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研究テーマ
1. 魚類(ヒラメ・メダカ)の性決定・性分化機構の解明
2. 魚類(ヒラメ・メダカ)を用いた内分泌撹乱物質のモニタリングシステムの開発

研究内容

1. 魚類(ヒラメ・メダカ)の性決定・性分化機構

　ヒラメとメダカの性は、通常は遺伝的に決定され、ＸＸ個体は雌へ、ＸＹ個体は雄へと分化します。しかしながら、性分化時期に性ホルモン処理を行うことで、容易に性転換を誘導することができます。特にヒラメは、性分化時期の高水温処理によりＸＸ個体は雄へと性転換するなど、外的要因に対して大変感受性が高い実験動物です(原著論文 18)。そこで我々は、ヒラメを用いて性分化における性ホルモンの役割を調べました。ヒラメからアロマターゼ(アンドロゲンをエストロゲンに変換する酵素)、エストロゲンレセプター(ER)αとERβ、11β-水酸化酵素(魚類特異的アンドロゲンである11-ケトテストステロンの合成に関与する酵素)の遺伝子を単離し、温度コントロールにより誘導した雌雄の生殖腺におけるこれら遺伝子の発現を調べました(原著論文 13, 21)。その結果、アロマターゼ遺伝子の発現は、性分化開始以降、雌では急激に増加しましたが、雄では減少しました。ERαとERβ遺伝子の発現は、両者とも性分化時期における雌雄差は認められませんでした。一方、11β-水酸化酵素遺伝子の発現は、雄においてのみ、性分化後に増加しました。さらに、性分化時期のＸＸ個体にアロマターゼ阻害剤(ファドロゾール)または抗エストロゲン剤(タモキシフェン)を投与することで雄へと性転換したことから、雌への性分化にはエストロゲンが不可欠で、雄への性分化にはエストロゲン合成の抑制が重要であると考えられました(原著論文 1, 19)。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

　最近、我々はミュラー管抑制物質(MIS)の魚類ホモログの単離に成功しました(原著論文 6)。MISは、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、哺乳類、鳥類、爬虫類において、性分化時期に雄特異的な発現を示します。ＸＸヒラメを18℃飼育により雌へ、11-ケトテストステロン処理または27℃飼育により雄へと分化誘導し、性分化時期におけるこれら雌雄の生殖腺でのMIS mRNAの発現をin situ hybridization法により調べた結果、性的未分化時期においてすでに性差が認められ、雄の生殖腺では強く、雌の生殖腺では弱いことがわかりました。また、性分化時期におけるMIS mRNAの発現は、雌の生殖腺では検出されず、雄の生殖腺の支持細胞でのみ観察されました。これらのことから、性分化時期でのMIS mRNAの発現パターンは、哺乳類、鳥類、爬虫類と同様に、ヒラメにおいても保存されていると思われます。魚類の性分化におけるMISの生理的機能はまだ明らかではないため、現在、MISの役割について詳細に調べているところです。

　一方、メダカは、小型でライフサイクルが短く、性を外観で確認することができるため、性転換する突然変異体を作製するために大変優れた実験動物です。我々は、原因遺伝子の同定が容易なエンハンサートラップ法を用いて、性転換の突然変異体の作製を精力的に行っています。また、いくつかの性決定・性分化関連因子を単離し、遺伝子ノックダウン技術を用いてそれら因子の機能解析を行うことにより、多大な成果をあげています。

卵母細胞が緑色蛍光を発する遺伝子導入メダカ系統
　　　　(エンハンサートラップ系統)

2. 魚類(ヒラメ・メダカ)を用いた内分泌撹乱物質のモニタリングシステムの開発

　近年、多くの内分泌撹乱物質が環境中に存在することが明らかになり、生物への影響が懸念されています。例えば、今もなお沿岸域に存在する有機スズは、ヒラメＸＸ個体を雄へと性転換させることが明らかになっています(原著論文 9)。そこで我々は、これら物質が生物に与える影響の分子メカニズムを明らかにし、これら物質のモニタリングシステムの開発を行う目的で、まず、エストロゲン様作用物質の作用機構を調べるためのレポーターアッセイシステムを構築しました(原著論文 2)。エストロゲン応答遺伝子であるビテロゲニン遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を連結したベクター及びヒラメERαまたはERβの強制発現ベクターを培養細胞に導入し、Luc活性を調べました。その結果、ERαとERβのどちらを導入しても、E2の濃度依存的にLuc活性は上昇しました。次に、このシステムを用いて、ヒラメの雌化を誘導する3種類のエストロゲン様作用物質(ノニルフェノール、ビスフェノールA、ゲニスタイン)の作用機構を調べました(原著論文 2)。その結果、ノニルフェノール及びビスフェノールAは、ERβよりもERαを導入した方が明らかにLuc活性を誘導しましたが、ゲニスタインは、ERαとERβのどちらを導入しても同様にLuc活性を誘導したことから、ノニルフェノール及びビスフェノールAは主にERαを介して、ゲニスタインはERαとERβ両方を介してエストロゲン様作用を行うと考えられました。このシステムは、エストロゲン様作用物質の高感度なin vitro モニタリングシステムとして広く利用できると思われます。今後は、生体内で評価できるモニタリング用トランスジェニックフィッシュの作製を行っていきたいと考えています。

1) Kitano T., Yoshinaga N., Shiraishi E., Koyanagi T. and Abe S., "Tamoxifen induces masculinization of genetic females and regulates P450 aromatase and Mullerian inhibiting substance mRNA expression in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Molecular Reproduction and Development, 2006 (In press).

2) Kitano T., Koyanagi T., Adachi R., Sakimura N., Takamune K. and Abe S., "Assessment of estrogenic chemicals using an estrogen receptor α (ERα)- and ERβ-mediated reporter gene assay in fish", Marine Biology, 149, 49-55, 2006.

3) Nakata H., Nasu T., Abe S., Kitano T., Fan Q., Li W. and Ding X., "Organochlorine contaminants in human adipose tissues from China: mass balance approach for estimating historical exposure to DDTs by Chinese", Environmental Science and Technology, 39, 4714-4720, 2005.

4) Nakata H., Hirakawa Y., Kawazoe M., Nakabo T., Arizono K., Abe S., Kitano T., Shimada H., Watanabe I., Li W. and Ding X., "Concentrations and compositions of organochlorine contaminants in sediments, soils, crustaceans, fishes and birds collected from lake Tai, Hangzhou bay and Shanghai city region, China", Environmental Pollution, 133, 415-429, 2005.

5) Shiraishi E., Imazato H., Yamamoto T., Yokoi H., Abe S. and Kitano T., "Identification of two teleost homologs of the Drosophila sex determination factor, transformer-2 in medaka (Oryzias latipes)", Mechanisms of Development, 121, 991-996, 2004.

6) Yoshinaga N., Shiraishi E., Yamamoto T., Iguchi T., Abe S. and Kitano T., "Sexually dimorphic expression of a teleost homologue of Mullerian inhibiting substance (MIS) during gonadal sex differentiation in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus", Biochemical and Biophysical Research Communications, 322, 508-513, 2004.

7) Nagahama Y., Nakamura M., Kitano T. and Tokumoto T., "Sexual plasticity in fish: a possible target of endocrine disruptor action", Environmental Sciences, 11, 73-82, 2004.

8) Uchida D., Yamashita M., Kitano T. and Iguchi T., "An aromatase inhibitor or high water temperature induce oocyte apoptosis and deletion of P450 aromatase activity in the gonads of genetic female zebrafish during sex-reversal", Comparative Biochemistry and Physiology Part A, 137, 11-20, 2004.

9) Shimasaki Y., Kitano T., Oshima Y., Inoue S., Imada N. and Honjo T., "Tributyltin causes masculinization in fish", Environmental Toxicology and Chemistry, 22, 141-144, 2003.

10) Ohta K., Sundaray J.K., Okida T., Sakai M., Kitano T., Yamaguchi A., Takeda T., Matsuyama M., "Bi-directional sex change and its steroidogenesis in the wrasse, Pseudolabrus siebldi", Fish Physiology and Biochemistry, 28, 173-174, 2003.

11) Yazawa T., Nakayama Y., Fujimoto K., Matsuda Y., Abe K., Kitano T., Abe S. and Yamamoto T., "Abnormal spermatogenesis at low temperatures in the Japanese red-bellied newt, Cynops pyrrhogaster: Possible biological significance of the cessation of spermatocytogenesis", Molecular Reproduction and Development, 66, 60-66, 2003.

12) Yamamoto T., Yazawa T., Fujimoto K., Kitano T. and Abe, S., "Low temperature promotes annexin v expression in newt testis", Zoological Science, 20, 733-735, 2003.

13) Kitano T., Takamune K., Nagahama Y. and Abe S.-I., "Gonadal sex differentiation in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus", Fisheries Science, 68, 679-680, 2002.

14) Nakata H., Kawazoe M., Arizono K., Abe S., Kitano T., Shimada H., Li W. and Ding X., "Organochlorine Pesticides and Polychlorinated Biphenyl Residues in Foodstuffs and Human Tissues from China: Status of Contamination, Historical Trend, and Human Dietary Exposure", Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 43, 473-480, 2002.

15) Uchida D., Yamashita M., Kitano T. and Iguchi T., "Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish", Journal of Experimental Biology, 205, 711-718, 2002.

16) Shimasaki Y., Oshima Y., Yokota Y., Kitano T., Nakao M., Kawabata S., Imada N. and Honjo T., "Purification and identification of a tributyltin-binding protein from serum of Japanese flounder, Paralichthys olivaceus", Environmental Toxicology and Chemistry, 21, 1229-1235, 2002.

17) Fujimoto K., Yamamoto T., Kitano T. and Abe S.-I., "Promotion of cathepsin L activity in newt spermatogonial apoptosis induced by prolactin", FEBS Letters, 521, 43-46, 2002.

18) Kitano T., Takamune K., Nagahama Y. and Abe S.-I., "Role of P450 aromatase in gonadal sex differentiation in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Environmental Sciences, 8, 1-11, 2001.

19) Kitano T., Takamune K., Nagahama Y. and Abe S.-I., "Aromatase inhibitor and 17a-methyltestosterone cause sex-reversal from genetical females to phenotypic males and suppression of P450 aromatase gene expression in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Molecular Reproduction and Development, 56, 1-5, 2000.

20) 北野健、山本栄一、高宗和史、安部眞一, "アロマターゼmRNAの検出によるヒラメ人工種苗の早期性判別について", 日本水産学会誌, 66, 300-301, 2000

21) Kitano T., Takamune K., Kobayashi T., Nagahama Y. and Abe S.-I., "Suppression of P450 aromatase gene expression in sex-reversed males produced by rearing genetically female larvae at a high water temperature during a period of sex differentiation in the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Journal of Molecular Endocrinology, 23,167-176,1999

[国際会議] 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

1) Kitano T., Adachi R., Yoshinaga N. and Abe S., "Role of androgen in gonadal sex differentiation in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", The 15th International Congress of Comparative Endocrinology (Boston, USA), 23-27 May 2005.

2) Shiraishi E., Yoshinaga N., Miura T., Wakamatsu Y., Ozato K., Abe S. and Kitano T., "Mullerian inhibiting substance is required for sexually dimorphic proliferation of germ cells during gonadal sex differentiation in medaka (Oryzias latipes)", The 15th International Congress of Comparative Endocrinology (Boston, USA), 23-27 May 2005.

3) Yang J., Adachi R., Yoshinaga N., Abe S. and Kitano T., "Effects of estrogen and estrogenic chemicals on gonadal sex differentiation in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", The 15th International Congress of Comparative Endocrinology (Boston, USA), 23-27 May 2005.

4) Ohta K., Sundaray J.K., Kitano T., Shibata Y., Matsuda M., Yamaguchi A., Matsuyama M. and Nagahama Y., "Involvement of 17b-hydroxysteroid dehydrogenase in the sex change of a protogynous wrasse, Pseudolabrus sieboldi", The 15th International Congress of Comparative Endocrinology (Boston, USA), 23-27 May 2005.

5) Kitano T., Yoshinaga N., Adachi R. and Abe S., "Action of 11-ketotestosterone in gonadal sex differentiation in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", 5th International Symposium of Fish Endocrinology (Castellon, Spain), 5-9 September 2004.

6) Kawakami Y., Kitano T., Adachi S., Yamauchi K. and Ohta H., "Transcriptional activity of conger eel thyroid hormone receptors with thyroid hormone", 5th International Symposium of Fish Endocrinology (Castellon, Spain), 5-9 September 2004.

7) Kitano T. (Invited), Koyanagi T. and Abe S.-I., "The mechanism of transcriptional regulation of vitellogenin gene in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Abstract of 7th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish (Mie), P104, 2003.

8) Kitano T., Yamaguchi S. and Abe S.-I., "The mechanism of transcriptional regulation of P450 aromatase gene by two FTZ-F1 homologues in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Abstract of Third International Symposium on Vertebrate Sex Determination (Hawaii), P98-99, 2003.

9) Kitano T., Takamune K., Nagahama Y. and Abe S.-I., "Gonadal sex differentiation in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Abstracts of International Commemorative Symposium: 70th Anniversary of the Japanese Society of Fisheries Science (Yokohama), P110, 2001.

10) Kitano T., Takamune K., Nagahama Y. and Abe S.-I., "Role of estrogen in gonadal sex differentiation in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Proceedings of 14th International Congress of Comparative Endocrinology (Italy), P233-237, 2001.

11) Kitano T. (Invited), "Role of aromatase in gonadal sex differentiation in fish", Abstracts of Korea-Japan Endocrine Disrupters Symposium (Korea), P25-26, 2000.

12) Kitano T. (Invited), Takamune K., Nagahama Y. and Abe S.-I., "Role of aromatase in gonadal sex differentiation in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)", Abstracts of International Symposium on Endocrine-Disrupting Substance Testing in Medaka, P58, 2000

13) Kitano T., Yamamoto E., Tanaka M., Takamune K. and Abe S.-I., "Detection of cytochrome P450 aromatase mRNA by RT-PCR is an excellent method for sex distinction of early juveniles in Japanese flounder(Paralichthys olivaceus)", Abstracts of Fourth International Symposium on Flatfish Ecology, P36, 1999

14) Yamamoto E. and Kitano T., "Importance of the sex determining characteristics in flatfish study", Abstracts of Fourth International Symposium on Flatfish Ecology, P83, 1999

[特許]
1) 北野健、安部眞一, "魚類の性判別法", 特願平10-240401号, 平成10年8月に特許出願

[外部資金の取得状況]
1) 特定領域研究「性分化機構の解明」, 2005-2007年, 750万円, 温度依存性性決定の分子メカニズム, 研究代表

2) 若手研究B, 2005-2007年, 360万円, メダカにおける性転換変異体の解析による雌化機構, 研究代表

3) 受託研究(アークリソース株式会社), 2005-2007年, 300万円, 魚類始原生殖細胞の増殖および分化誘導に関する研究, 研究代表

4) 戦略的基礎研究(CREST), 2000-2005年, 4500万円, 魚類の生殖系に及ぼす内分泌撹乱物質の影響の分子メカニズム, 研究分担

5) 日本学術振興会共同研究, 2000-2003年, 300万円, 中国に棲息する魚に対する内分泌撹乱物質の影響調査, 研究分担

6) UK-JAPAN PROJECT, 2001-2004年, 100万円, 魚類を用いた内分泌撹乱物質の影響評価, 研究分担

7) トヨタ先端科学技術研究助成, 2000-2002年, 400万円, ヒラメを用いた内分泌撹乱物質モニタリングシステムの開発, 研究分担

8) 日本生命財団研究助成, 2000-2002年, 400万円, ヒラメの性分化に及ぼす内分泌撹乱物質の影響, 研究分担